SSR分子標記技術及其在構建玉米DNA指紋庫上的應用

康麗麗 周鴻飛(沈陽農業大學農學院)

玉米是一種重要的飼用、糧用和工業加工作物，在國民經濟中占有重要的地位。玉米育種方法的改進對農業發展具有重要意義。長期以來，育種家們大多數是借用易于鑒別的形態學和同工酶等遺傳標記來輔助育種，并取得了很大成功。但這類標記的最大不足之處在于其數量有限，要找到與目標性狀密切相關的標記往往很困難，難以應用于育種實踐。因此，育種家們一直希望能夠找到一類數量豐富、選擇效應高的標記，以提高育種效率和育種過程的預見性。隨著分子生物學的發展，開發了基于DNA變異的分子標記。應用最廣泛的主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP等，其中SSR標記是一種共顯性標記，重復性好，可靠性高，分析簡便，易于實現自動化，而且靈敏度高，檢測遺傳變異的能力強。近年來，SSR標記在玉米育種中得到了廣泛的應用。

1 SSR標記

1．1 SSR標記的原理

簡單重復序列(Simple sequence repeat.SSR)，又稱為微衛DNA(Microsatellite DNA)。微衛星通常是指以2—4個核苷酸為單位多次串聯重復的DNA序列，也有少數以l一6個核苷酸為串聯重復單位。微衛星在基因組中的分布是隨機的，它可以存在于內含子、外顯子及染色體的其它任何區域。在不同植物中，微衛星重復單位的堿基組成及拷貝數隨物種的不同而有所差異，但人們發現微衛星兩端的序列是保守的。因此，可以設計出與微衛星兩端保守序列互補的引物，通過PCR擴增重復序列本身并通過凝膠電泳檢測其多態性。SSR序列多態性的出現是由于同一物種中不同基因型的寡核苷酸重復次數不同以及重復序列在染色體復制時的滑動或染色單體的不等交換造成的。因此，微衛星可用作分子標記。由于玉米中存在轉座子，微衛星的多態性表現得極為豐富，所以，通過特異性引物進行PCR擴增反應、瓊脂糖凝膠電泳(或聚丙烯酰胺凝膠電泳)、放射自顯影(或銀染)和GeneScan技術等，就可以檢測到在簡單重復序列重復單位數不同的DNA區域的多態性，這也是SSR技術較其它幾。種分子標記技術更適合于玉米研究的原因之一。

1．2 SSR標記的類型

按照重復單位的堿基數可將微衛星分為1～6核苷酸重復類型，其中二核苷酸重復有4種類型：(AT)n／(TA)n、(AG)n／(TC)n、(AC)n／(Gt)n、(GC)n／(CG)n；三核苷酸重復有10種類型：(AAT)n)/(TAT)n、(AAG)n／(TCT)n、(AAC)n／(TGT)n、(ATG)n／(TCA)n、(AGT)n／(TAC)n、(AGG)n／(TCC)n、(AGC)n／(TGC)n、(ACG)n／(TCG)n、(ACC)n／(TGG)n、(GGC)n／(CGC)n；四核苷酸重復類型有32種(Jurke，1995)。所有類型的微衛星中以單核苷酸重復和二核苷酸重復的微衛星在基因組中出現的頻率最高。同一重復類型中不同的堿基重復多態性也不一致。

另外，Weber(1990)按照微衛星核心序列結構的不同將微衛星標記分為三種類型：(1)完全型(perfect)，指核心序列以不間斷的重復方式構成的微衛星；(2)不完全型(imperfect)，指在微衛星的核心序列之間有幾個非重復堿基，但其兩端的連續重復的核心序列重復次數大于3；(3)復合型(compound)，指兩種或兩種以上的串聯核心序列由幾個連續的非重復堿基分隔開，但各種連續性的核心序列重復次數不少于5。

1．3 SSR的功能

SSR在真核生物基因組中的功能一直存在爭議。在植物基因組中，大多數串聯重復序列是非編碼的，所以長期以來人們一直認為SSR是一類“垃圾”DNA，是轉錄啞區，沒有明確的生理功能。隨著研究的深入，有關SSR功能的資料在不斷積累。總的來說，SSR的功能主要有以下幾個方面：有些SSR(通常為4～7個堿基重復型)存在于結構基因的轉錄區，并且編碼氨基酸；染色體末端的SSR有保護DNA完整性，避免降解、融合及丟失的功能；位于DNA調控區的SSR有提高或降低臨近基因轉錄速率的作用；SSR區可能是基因重組的熱點，是基因變異的來源；部分SSR具有產生轉錄啟動復合物或活化染色體的功能。所以人們相信，盡管大多數SSR確實沒有明確的生理功能，只是采取了某種策略來確保自身存活，但部分SSR序列確實是功能基因的一部分。

目前，已知至少有10種以上的人類遺傳疾病都與微衛星序列的突變有關。在引起這些疾病的相關基因附近、內含子或外顯子中，一般含有三核苷酸微衛星序列，其中患者中所攜帶的這些微衛星序列往往不穩定，而且長度通常比正常人的更長。在植物中也發現了一些性狀與微衛星序列長度變化密切相關。例如，水稻6號染色體上的Wx基因編碼一種淀粉合成酶，它與水稻胚乳中直鏈淀粉的合成有關。在Wx基因的5’非轉錄區有1個微衛星序列(CT)n，該序列的長度與不同品種的直鏈淀粉含量高低具有明顯的相關性。一般認為，微衛星序列可能在基因的表達調控、染色體結構、染色體重組、新基因的起源及演化等方面有著重要的意義。

1．4 SSR標記的引物來源

微衛星DNA分析成功與否的關鍵因素有兩個，一是PCR擴增的效果，另一個就是側翼序列引物的來源。一般來說，微衛星擴增的引物來源有四個：一是直接應用已發表的微衛星DNA引物；二是使用近緣種的引物；三是通過篩選DNA序列數據庫，或篩選克隆文庫的簡單重復DNA序列，借助于計算機軟件進行引物設計；四是最好也是最根本的方法，即構建基因組文庫，再根據微衛星位點兩翼的序列來設計引物。