比色計原理

當單色光通過厚度相同，而濃度很小的溶液時，根據朗伯—比爾定律，光被溶液吸收的程度，稱為吸收度，與溶液的濃度成正比，與溶液的厚度成正比，即A=εCL，式中：A為吸收度，C為溶液的濃度，L為溶液的厚度，ε為消光系數。

由朗伯—比爾定律得，當一束單色光通過一溶液時，由于溶液吸收一部分光能，使光的強度減弱。若溶液的濃度（或厚度）不變，則溶液的厚度（濃度）愈大，光線強度的減弱也愈明顯。

       用同樣的方法配制的標準溶液和待測溶液，其濃度分別為C1和C2，對同類溶液ε相同，當厚度也相同時則：

A1=εC1L

A2=εC2L

C2=（A2/A1）*C1

       式中A1,A2可由比色計直接讀出，C1為標準溶液的已知濃度，據此可算出待測溶液的濃度。

朗伯—比爾定律

許多化學物質的溶液具有顏色（無色的化合物也可以加顯色劑經反應生成有色物質），當有色溶液的溶度改變時，顏色的深淺也隨之改變，濃度愈大，顏色愈深。因此，可以用比較溶液顏色深淺的方法來測定有色溶液的濃度。這種方法叫做比色分析法。

一、 朗伯—比爾定律

當一束單色光通過有色溶液時，入射光線的一部分被器皿反射回來，一部分被溶液吸收，另一部分則透過溶液，如圖所示。它們之間有以下關系：

Io=Ia+Ir+It      1-1

式中：Io—入射光強度，Ia—吸收光強度，Ir—反射光強度，It—透過光強度

由于在實際測定時，所用的比色皿都是同質料用規格的。反射光的強度為一定值，不會引起測量誤差，所以反射光的影響可以不加考慮。則上式可簡化為：

Io=Ia+It        1-2

從式1-2可知：當入射光強度Io為一定時，被吸收光強度Ia愈大，則透過光強度It愈小。也就是說：光強度的減弱僅與有色溶液對光線的吸收有關。

那么，溶液對光線的吸收與哪些因素有關呢？實驗證明：溶液的濃度C愈大，液層厚度L愈厚（即光線在溶液中所經過的路程愈長），則溶液對光線吸收的愈多。它們之間的關系有下式決定：

lg = KCL       1-3

這個公式就是朗伯—比爾（Lambert---Beer）定律。

公式中的K稱為吸光系數，它表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時的吸光度。在入射光的波長、溶液種類和溫度一定的條件下，K為定值。吸光系數是有色化合物的重要特性之一，在比色分析中有著重要的意義。K值愈大，表示該物質對光的吸收能力愈強，濃度改變時引起吸光度的改變愈顯著，因此比色測定時靈敏度愈高。

朗伯-比爾定律即有色溶液對一定強度光的吸收程度，與液層厚度和溶液中有色物質濃度的乘積成正比。其中朗伯定律說明吸收光與厚度間的關系；比爾定律說明吸收光與濃度間的關系。

朗伯—比爾定律在光電比色計中的應用

假定有兩種有色溶液，其中一種是已知濃度的標準溶液，另一種是待測溶液。根據公式：

在標準溶液中：As=KsCsLs 1-4

在待測溶液中：Ax=kxCxLx 1-5

將式1-4除以式1-5可得：

= 1-6

如果上述兩種溶液的液層厚度相等、溫度相同而且是同一種物質的兩種不同濃度的溶液，測定時所選用的單色光的波長亦相同，則有：

Ls=Lx、Ks=Kx ，代入式1-6可得：

= 1-7

由此可見，在上述條件下，吸光度與濃度成正比。這一關系式就是光電比色計的設計依據，也是比色分析的基本計算公式之一。式中標準溶液的濃度Cs為已知，As和Ax可用光電比色計測量出來，則待測溶液的濃度Cx即可求出：

Cx = × Cs 1-8

由于在實際測定時，標準溶液和待測溶液都要加以稀釋，而且在報告結果時，多以100毫升（或1000毫升）中的含量來表示。因此，在實際計算時，就需要在上式中乘上稀釋因數。

求待測溶液濃度的方法有：直接比較法（計算法）、因數法和標準曲線法三種。這些方法在“生物化學及生物化學檢驗技術”課程中有介紹。

波長的選擇：

由于有色溶液對光的吸收具有選擇性，因此進行比色測定時，濾光片必須加以選擇，否則靈敏度很低，導致測量結果不準確。選擇濾光的一般原則是：濾光片最大透過的光線應該是溶液最大吸收的光線。從顏色上看，濾光片的顏色與待測溶液的顏色應為“互補色”。

什么叫做互補色呢？凡是兩種顏色相加后能得到白色，則此兩種顏色就稱為“互補色”，圖中直接相對的兩種顏色，均為互補色。

為什么選擇濾光片時，要使濾光片的顏色與待測溶液的顏色為互補色呢？這是因為濾光片和有色溶液具有相似的透光特性，與它們本身顏色相同的色光，能夠最大限度地透過。而與它們本身顏色成互補的色光都能被最大地吸收。

圖 羅維朋比色計